Kromotografik ve Spektroskopik Yöntemlerle Miktar Tayini- Sterol, Yumurta Sarısı vs...

1.    Spektroskopik Yöntemlerle Miktar Tayini:

      Spektroskopi, bir örnekteki atom, molekül veya iyonların, alt enerji düzeyinden üst enerji düzeyine geçişleri sırasında absorplanan veya yayılan elektromanyetik ışımanın ölçülmesidir.

      Genel olarak bir spektroskopik cihaz; bir numune kabı, bir ışın kaynağı, bir dalga boyu seçici, ışının şiddetini ölçecek ve bu algılanan ışını sinyale dönüştürecek bir dedektörden oluşmaktadır.

Şekil: Spektometre kısımları

      Bu cihazların çalışma esası; Lambert-Beer eşitliğine göre moleküllerin monokromatik ışınları absorplamasına dayanır.

      Bu ana bileşenlere ek olarak spektrometrelerde ışığı toplamak, odaklamak, yansıtmak, iki demete bölmek ve örneğin üzerine belli bir şiddetle göndermek amacıyla mercekler, aynalar, ışık bölücüleri ve giriş çıkış aralıkları vardır. Örnek ise kullanılan dalga boyu bölgesinde ışını geçiren maddeden yapılmış örnek kaplarına konularak ışık yoluna yerleştirilir.

      Miktar tayininde kullanılan spektroskopik yöntemler aşağıdaki şekildedir;

·         Ultraviyole (UV) ve Görünür Bölge Absorpsiyon Spektroskopisi:

·         Atomik Absorpsiyon Spektroskopisi (AAS):

·         Atomik Emisyon ve Atomik Floresans Spektroskopisi:

·         İnfrared (IR)Spektroskopisi:

·         Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi

·         Kütle Spektrometresi

Uygulamada en yaygın kullanılan spektroskopik miktar tayin yöntemi Ultraviyole (UV) ve Görünür Bölge Absorpsiyon Spektroskopisidir. Ultraviyole ve görünür ışık (UV-Vis) moleküllerdeki elektronik geçişlerin verdiği spektrumları konu alır, olay; bir ışın demetinin bir örnekten geçtikten veya bir örnek yüzeyinden yansıtıldıktan sonraki azalmasının ölçülmesi şeklindedir. Işığın şiddetinin azalması absorplamanın arttığını gösterir. Ölçülen maddenin  konsantrasyonu  belirli bir dalga boyundaki absorpsiyonu ölçülerek  bulunur. Bu yöntemle ölçümler, çözeltideki moleküller veya inorganik iyon ve komplekslerin analizlerinde kullanılır. Genellikle çoğu  molekül UV veya Vis dalga boylarını absorplar ve farklı moleküller  farklı dalga boylarında  absorbans gösterirler. Sonuç spektrumu molekülün yapısını gösteren birçok absorplama bantlarından oluşur. Elektronik spektrum 100-700 nm aralığını kapsar; 100-200 nm aralığı Vakum UV, 200-400 nm aralığı UV (veya yakın UV) ve 400-700 nm aralığı görünür bölgedir. Bir bileşik görünür bölgede absorbsiyon yaparsa renklidir ve absorbladığı rengin tamamlayıcı renginde görünür. 2 çeşit olarak sınıflandırılabilir: Tek ısın yollu ve çift ışın yollu spektrofotometreler şeklinde. Aralarındaki fark tek ışın yollu spektrofotometrede sıfır ayarı ve ölçüm ayarları cihazda tek ışın demeti olduğu için ayrı ayrı yapılır. Çift ışın yollu spektrofotometrelerde ise bu işlem ayrı ayrı yapılmaz çünkü monokromatörden çıkan ışık eşit şiddette iki demete bölünerek biri örneğe, diğeri ise sadece çözücünün bulunduğu kaba gönderilir. Böylece örnekteki geçirgenlik değeri sürekli olarak çözücününki ile karşılaştırılmış olur.

Bu çalışmada kullanılacak “Çift ışın yollu spektrofotometre” dir. 

Şekil: Çift ışın yollu spektrofotometrenin şematik yapısı

Spektrofotometrede ölçüm yapılırken numuneye belirli bir dalga boyundaki ışın gönderilerek numunenin absorbe ettiği ışın miktarı ölçülür. Yapılan analize göre ölçümde hangi dalga boyundaki ışının kullanılacağı analiz metodunda belirtilmektedir. Kullanılacak ışın dalga boyu bilinmiyorsa miktarı tespit edilecek maddenin 1 molar çözeltisi hazırlanıp çeşitli dalga boylarındaki absorbans değerleri ölçülür. En yüksek değerin ölçüldüğü dalga boyu belirlenerek kullanılır. Spektrofotometre bu dalga boyuna ayarlanarak çözeltilerin ölçümüne geçilir.

Spektrofotometrik ölçüm için üç tip çözelti hazırlanır. Bunlar: Kör, numune ve standart çözeltileridir.

a.    Kör (tanık, şahit) Çözelti: Spektrofotometrede okuma yapmadan önce absorbansı sıfıra veya %transmittansı 100’e ayarlamak için kullanılan çözeltidir. Bu amaçla yapılan işleme “kör ayarı” veya “0 ve 100 ayarı” denir. Üç tip kör çözeltisi vardır. Bunlar:

·         Optik kör; standart çözelti serisi hazırlanırken stok standart çözelti hariç diğer kimyasalların konulmasıyla hazırlanan 0,0 konsantrasyonlu çözeltidir. Çözeltilerden ve küvetten gelebilecek absorbansları ortadan kaldırmak için kullanılır. Bunun analiz öncesi yapılması zorunlu olmakla beraber analiz sırasında da yapılması gerekebilir.

·         Reaktif körü; bulanık veya renkli reaktifler kullanıldığında içinde sadece o reaktifin olduğu kör çözelti olup o reaktiften gelebilecek absorbansı tespit etmek için kullanılır.

·         Numune körü; renkli veya bulanık numunelerin kullanıldığı ölçümlerde numunenin renginden gelebilecek absorbansı tespit etmek için kullanılan, içinde sadece numunenin bulunduğu kör çözeltidir.

Spektrofotometre optik köre karşı sıfıra ayarlanmışsa reaktif körünün absorbans değeri, numune ve standartların absorbansından çıkarılır. Numune körünün absorbansı ise sadece numunenin absorbansından çıkarılarak hesaplama yapılır.

b.    Standart Çözelti: Miktarı bulunmak istenen maddenin bilinen konsantrasyonlardaki çözeltisidir. Bir veya birden fazla olabilir. Birden fazla olduğunda grafik çizilir.

c.     Numune Çözeltisi: İçindeki madde miktarını tespit etmek istediğimiz çözeltidir.

Spektrofotometrik ölçüm yapılırken şu aşamalar takip edilir:

·         Ölçümden yeterli süre önce cihaz çalıştırılarak ısınması sağlanır.

·         Cihaz ölçümün yapılacağı dalga boyuna ayarlanır.

·         Küvete kör çözelti konularak cihaza yerleştirilir.

·         Kör çözelti ile cihazın 0 ve 100 ayarı yapılır.

·         Küvete standart çözeltilerden konularak cihaza yerleştirilip okumaları yapılır.

·         Küvete numune çözeltisi konularak cihaza yerleştirilip okuması yapılır.

·         Kalibrasyon (absorbans) eğrisi çizilerek, numunenin konsantrasyonu hesaplanır.

Okumalar tamamlandıktan sonra ya numunenin absorbans değeri sabit faktör ile çarpılarak numunenin konsantrasyonu hesaplanır veya kalibrasyon grafiği çizilip bu grafik yardımıyla numunenin absorbans değerinden konsantrasyonu tespit edilir.

“Ultraviyole (UV) ve Görünür Bölge Absorpsiyon Spektroskopisi” ile yapılabilen nicel (kantitatif) analizlerin bazıları aşağıdaki şekildedir:

·         Demir Tayini

·         Krom Tayini

·         Suda Fosfat Tayini

·         Suda Sülfat Tayini

·         Suda Nitrat Tayini

·         Mayonezde Yumurta Sarısı Tayini

·         Et ve Et Ürünlerinde Nitrat / Nitrit Tayini

·         Et ve Et Ürünlerinde Kreatinin Tayini

·         Sodyum Benzoat (Benzoik Asit) tayini

·         Potasyum Sorbat (Sorbik Asit) Tayini

·         Meyve ve Meyve Ürünlerinde Hidroksimetil Furfural (HMF)Tayini

·         Yağda Fosfor Tayini

1.1.        Uygulama Örneği: Yumurta Sarısı Miktarı Tayini

Kapsam: Mayonezde bulunan yumurta sarısının miktarının tayini kapsar.

İlkesi: Standart çözelti serileri hazırlayarak spektrofotometrik okuma sonrası oluşturulan kalibrasyon eğrisinden, numune içindeki yumurta sarısı miktarının tayini ilkesine dayanır. TS 7437 ye göre analiz yapılmaktadır.

Kullanılan Kimyasallar:

Stok Standart Fosfat Çözeltisi:

• 500 ml.lik balonjoje içine 100 ml stok fosfat çözeltisi[1] konulur.
• Saf su ile balonjoje çizgisine kadar seyreltilir.

• İçeriğin iyice karışması sağlanır.

• Bu çözeltinin 1 ml.si 0,2 mg fosfor ihtiva eder.

Amonyum Molibdat – Amonyum Vanadat Çözeltisi:

• 40 gram amonyum molibdat tetrahidrat ((NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O) 400 ml saf ılık suda (50 °C) çözülür.
• 1 litrelik bir balon jojeye 1,0 gram amonyum vanadat (NH₄VO₃) tartılır. 300 ml saf sıcak su eklenerek çözülür, soğutulduktan sonra 200 ml derişik nitrik asit yavaş yavaş ilave edilir. Çözelti dikkatli şekilde karıştırılır.
• Amonyum molibdat çözeltisi, amonyum vanadat çözeltisinin üzerine eklenir.
• Saf su ile 1 litreye tamamlanır.

Absolu Metil Alkol

Sülfürik Asit + Nitrik Asit Karışımı

Amonyum Hidroksit

Nitrik Asit

---

[1] Stok Fosfat Çözeltisi:

·          Potasyum Dihidrojen Fosfat (KH₂PO₄), kullanımdan önce 2 saat 101°C.da kurutulur.

·          1,0967 g kuru potasyum dihidrojen fosfat (KH₂PO₄) ± 0,001 hassasiyetle tartılır.

·          Saf su ile çözülerek, 250 ml.ye tamamlanır.

·          İçeriğin iyice erimesi sağlanır.

·          Bu çözeltinin 1 ml.si 1 mg fosfor ihtiva eder.

İşlem Basamakları:

• Öncelikle “Standart Grafiği” nin çizilmesi ile ilgili işlemler uygulanır. Bunun için hazırlanmış olan stok standart fosfat çözeltisinden aşağıda hesaplanan miktarlar alınarak belirtilen şekilde grafik çizilir;
  
  
  
  

  Fosfor İçeriği	C1 X V1 = C2 X V2	Alınacak Stok Standart Fosfat Çöz. Miktarı (ml)
  0 mg / l	189,9[1] mg /l X V1 = 0 mg / l X 100 ml	0 (KÖR ÇÖZELTİ)
  2,4 mg / l	189,9 mg /l  X V1 = 2,4 mg / l X 100 ml	1,25
  4,7 mg / l	189,9 mg /l X V1 = 4,7 mg / l  X 100 ml	2,5
  9,5 mg / l	189,9 mg /l X V1 = 9,5 mg / l X 100 ml	5
  19 mg / l	189,9 mg /l X V1 = 19 mg / l x 100 ml	10
  28,5 mg / l	189,9 mg /l X V1 = 28,5 mg / l x 100 ml	15
  38 mg / l	189,9 mg /l X V1 = 38 mg / l x 100 ml	20
  47,5 mg / l	189,9 mg /l X V1 = 47,5 mg / l x 100 ml	25

  
  

  ---

  [1]    (PO₄ molekül ağırlığı (P:15 ,O :16) : 15+(4x16) =79 g /mol

  79 g PO₄  ‘da 15 g P (Fosfor varsa) 

          1000 mg PO₄ ‘da   189, 9 mg P  Fosfor vardır.)
  

  
  

  ·       8 adet 100 ml’lik balon joje alınıp üzerlerine hazırlanacak çözelti konsantrasyonları yazılır.

  ·       Balon jojelere hazırlanacak konsantrasyonuna göre hesaplanan miktarlarda stok standart fosfor çözeltisi aktarılır.

  ·       Her bir balon jojeye yaklaşık 50 ml saf su ve 25 ml amonyum molibdat - amonyum vanadat çözeltisi eklenip saf su ile hacim çizgilerine (100 ml ye) tamamlanır.

  ·       İstenilen sarı rengin oluşması için 10 dakika beklenir.

  ·       Optik dansiteleri 470 nm de okuma yapılarak grafik çizilir.

  
  
  
  

• Standart grafiğinin çizilmesinden sonra “Tayin” in yapılması işlemlerine aşağıdaki şekilde başlanır;

·       20 g sos numunesi, 100 ml absolu metil alkol ile 6 saat dik soğutucu altında kaynatılır.

·       Sistem bir gece kendi haline bırakılır.

·       Bir gece bekletilen numune filtre kağıdından süzüldükten sonra, süzüntü tekrar metilalkol ile ekstre edilir

·       Ekstraksiyon sonunda süzüntüden kalan numune tekrar metil alkol ile yıkanır.

·       Süzüntü ve yıkama çözeltileri 250 ml lik bir balonda toplanır.

·       Toplanan ve ekstrakte edilen bu çözeltiler su banyosunda buharlaştırılarak kurutulur.

·       Kalan numune 25 ml sülfürik asit ve 25 ml nitrik asit karışımı ile yaş yakmaya tabi tutulur.

·       Kalan numune saf su ile yıkanarak 100 ml’lik bir ölçülü balona alınır ve balon oda sıcaklığında 100 ml ’ye saf su ile tamamlanır.

·       Karıştırılır ve süzülür.

·       Süzüntüden pipetle 50 ml alınarak 100 ml’lik diğer bir ölçülü balona aktarılır.

·       Amonyum hidroksit ile nötürleştirilir ve seyreltik nitrik asitle asitlendirilir.

·       Üzerine amonyum molibdat – amonyum vanadat çözeltisinden 25 ml ilave edilir ve işaret çizgisine kadar saf su ile tamamlanır.

·       Numune iyice karıştırıldıktan sonra 470 nm’de absorbansı ölçülür. Standart grafikten tekabül ettiği P₂O₅ (fosfor pentaoksit) miktarı bulunur.

Hesaplama:

 Deney numunesinin konsantrasyonun grafikten bulunan P₂O₅ (fosfor pentaoksit) miktarına göre yumurta sarısı miktarı aşağıdaki formülle bulunur.

% Yumurta Sarısı Miktarı =(P2O5 х 56)/100

Analizi yapılmış bir mayonezde tespit edilen yumurta sarısı miktarı aşağıdaki şekilde tespit edilmiştir:

Konsantrasyon	ABS	Hesaplanmış konsantrasyon ((ABS+0,0187)/0,0382)
0	0	0,49
1,25	0,0405	1,55
2,5	0,0814	2,62
5	0,1694	4,92
10	0,3465	9,56
15	0,5131	13,92
20	0,7262	19,50
25	0,9851	26,28
NUMUNE	0,28	7,82

Yumurta Sarısı Miktarı = 7,82 * 56 / 100 = % 4,38

1.       Kromatografik Yöntemlerle Miktar Tayini

Kromatografi, bir sabit faz üzerinden hareketli faz geçirilerek, bir numunedeki bileşenlerin dağılma ve adsorpsiyon gibi mekanizmalar yoluyla farklı zaman süreçlerinde taşınma ve ayrılması işlemidir.

Bütün kromatografik metotlar numune içerisindeki maddelerin sabit ve hareketli fazla etkileşimi sonucu ayrışmaları esasına dayanır. Bu ayrışmanın nedeni, maddelerin hareketli veya sabit faza olan farklı ilgileridir.

Kromatografi tekniğinin temelinde üç ana unsur yer alır.

• Sabit faz: Bu faz daima bir "katı" veya bir "katı destek üzerine emdirilmiş bir sıvı tabakasından" oluşur.

• Hareketli faz: Bu faz daima bir "sıvı" veya "gazdan" oluşur.

• Sabit faz, hareketli faz ve karışımında yer alan maddeler arasındaki etkileşimin türü: Kromatografide "yüzey tutunması veya adsorpsiyon" ile "çözünürlük" olguları temel etkileşim türlerini oluştururlar. Şayet basit faz bir "katı" ise, karışımdaki maddelerle sabit faz arasında "yüzey tutunması (adsorpsiyon)" etkileşimi gerçekleşir.

Bu durumda farklı polaritelere (kutuplaşmalara)sahip maddelerin, farklı derecelerde yüzey tutunması göstermeleri doğaldır. Buna bağlı olarak, hareketli faz yardımı ile sabit faz üzerinden geçiş hızlarının da farklı olmaları beklenir. Bu tür etkileşim gösteren kromatografik yöntemlerin tümü "adsorpsiyon kromatografisi" genel adı ile anılırlar.

Şayet sabit faz bir "sıvı" ise, karışımdaki maddelerle sabit faz arasında "çözünme" etkileşimi gerçekleşir. Bu durumda farklı maddelerin, sabit ve hareketli fazlarda farklı çözünürlüklere sahip olmaları söz konusudur. Yani farklı maddelerin iki faz arasındaki dağılımları ön plana geçmektedir. Buna bağlı olarak hareketli faz yardımı ile sabit faz üzerinden geçiş hızlarının da farklı olmaları beklenir. Bu tür etkileşim gösteren kromatografik yöntemlerin tümü "dağılım kromatografisi" genel adı ile anılırlar.

Çeşitli kromatografik yöntemler vardır. Kromotografik yöntemlerin hepsi ağırlıklı olarak kantitatif analizlerde kullanılırlar. Bunlardan bazıları; Kolon kromatografisi, İnce tabaka kromatografisi (ITK), Kağıt kromatografisi, Gaz kromatografisi, İyon değişimi kromatografisi, Jel geçirgenlik kromatografisi, Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ve İlgi kromatografisidir.

                Uygulamalarda yaygın kullanılan yöntem gaz kromotograsidir. Bu çalışmada gaz kromotografisi ile yapılacaktır.

Gaz kromotografisi ile yapılabilen nicel (kantitatif) analizlere aşağıdaki örnekler verilebilir.

Yağ asit kompozisyonu

Sterol Kompozisyonu

Mumsu Madde (wax)

FAME – FAEE

Stigmastadienler

Pestisitler

1.1. Uygulama Örneği : Sterol Kompozisyonu (COI/T.20/Doc.no.10)

Kapsam: Bu yöntem hayvansal ve bitkisel katı ve sıvı yağlarda sterol içeriğinin ve bileşimlerinin, gaz kromatografik yöntem ile belirlenmesini kapsar.

İlkesi: Deney numunesi, geri akış altında etanollü potasyum hidroksit çözeltisi ile kaynatılarak sabunlaştırılır. Sabunlaşmayan madde, alüminyum oksit kolonunda katı faz ekstraksiyonu ile ortamdan ayrılır. Alüminyum oksit kolonu, yağ asiti anyonlarını alıkoymak üzere kullanılır ve bu esnada steroller kolondan geçerler. Sterol kısmı, sabunlaşmayan maddeden ince tabaka kromatografisi ile ayrılır. Sterol kısmının nicel ve nitel bileşimleri, gaz kromatografisiyle tayin edilir.

Kullanılan Kimyasallar:

·      α-cholestanol

·      Kolesterol

·      KOH

·      Etanol

·      2,7-dichlorofluoroscein indikatörü

·      Silika jel, Merck 1.05721

·      Dietil eter

·      Aseton

·      Toluen

·      Azot gazı

·      Fenolftalein

·      n – Hekzan

·      Kloroform

·      Piridin

·      Hegzametil disilazan

·      Klorotrimetilsilan

Çizim

Daha önce yapılan kalibrasyonlarla çıkan piklerin doğruluğu aşağıdaki tabloya göre (alıkonulma zamanlarına göre hazırlanmıştır) kontrol edilir. B-sitosterolün alıkonulma zamanı girildiğinde diğer piklerin tahmini yeri excel formatlı bu tabloda çıkacaktır.

STEROL ÇİZİM KONTROL
b-sitosterol
STEROL FRAKSİYONU	katsayı	tahmini alan
kolesterol	0,67	-
kolestanol	0,68	-
brasikasterol	0,73	-
ergosterol	0,78	-
24-metilen-kolesterol	0,82	-
kampesterol	0,83	-
kampestanol	0,85	-
stigmasterol	0,88	-
D-7-kampesterol	0,93	-
D-5,23-stigmastadienol	0,95	-
klerosterol	0,96	-
b-sitosterol	1,00	-
sitostanol	1,02	-
D-5-avenasterol	1,03	-
D-5-24-stigmastadienol	1,08	-
D7-stigmastenol	1,12	-
D-7-avenasterol	1,16	-
Eritrodiol	1,41	-
Uvaol	1,52	-

Hesaplama:

Hesaplama için aşağıdaki tablo kullanılır. (Excel olup numune miktarı, standart miktarı ve pik alanları girildiğinde kendisi hesaplama yapmaktadır.)

STEROL HESABI
numune miktarı
standart miktarı
STEROL FRAKSİYONU	PİK ALANI	%
kolesterol		#SAYI/0!	M 0.50
kolestanol
brasikasterol		#SAYI/0!	M 0.10
ergosterol
24-metilen-kolesterol		#SAYI/0!
kampesterol		#SAYI/0!	M 4.0
kampestanol		#SAYI/0!
stigmasterol		#SAYI/0!	< kampesterol
D-7-kampesterol		#SAYI/0!			SONUÇ:
D-5,23-stigmastadienol		#SAYI/0!			D7-stigmastenol	#SAYI/0!	M 0.50
klerosterol		#SAYI/0!			Toplam b-sitosterol	#SAYI/0!	m 93.00
b-sitosterol		#SAYI/0!			Toplam steroller	#SAYI/0!	m 1000
sitostanol		#SAYI/0!			Eritrodiol+Uvaol	#SAYI/0!	M 4.50
D-5-avenasterol		#SAYI/0!
D-5-24-stigmastadienol		#SAYI/0!
D7-stigmastenol		#SAYI/0!	M 0.50
D-7-avenasterol		#SAYI/0!
Eritrodiol		#SAYI/0!
Uvaol		#SAYI/0!
	0,00		0,00